蛋白質(zhì)的定量測(cè)定方法
【 實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/strong> 】
1.學(xué)習(xí)Folin-酚 試劑 法測(cè)定蛋白質(zhì)含量的原理。
2.掌握Folin-酚 試劑 法測(cè)定蛋白質(zhì)含量的方法和操作。
【 實(shí)驗(yàn)原理 】
蛋白質(zhì)中含有酪氨酸和色氨酸殘基，能與Folin-酚試劑起氧化還原反應(yīng)。反應(yīng)過(guò)程分為兩步，第一步：在堿性溶液中，蛋白質(zhì)分子中的肽鍵與堿性銅試劑中的Cu 2+ 作用生成蛋白質(zhì)-Cu 2+ 復(fù)合物；第二步：蛋白質(zhì)-Cu 2+ 復(fù)合物中所含的酪氨酸或色氨酸殘基還原酚試劑中的磷鉬酸和磷鎢酸，生成藍(lán)色的化合物。該呈色反應(yīng)在30分鐘內(nèi)即接近極限，并且在一定濃度范圍內(nèi)，藍(lán)色的深淺度與蛋白質(zhì)濃度呈線性關(guān)系，故可用比色的方法確定蛋白質(zhì)的含量。進(jìn)行測(cè)定時(shí)要根據(jù)蛋白質(zhì)濃度的不同選用不同的測(cè)定波長(zhǎng)：若蛋白質(zhì)含量高時(shí)（25-100μg）在500nm波長(zhǎng)處進(jìn)行測(cè)定，含量低時(shí)(5-25μg)在755nm波長(zhǎng)處進(jìn)行測(cè)定。最后根據(jù)預(yù)先繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線求出未知樣品中蛋白質(zhì)的含量。
Folin-酚試劑法操作簡(jiǎn)便，靈敏度高，樣品中蛋白質(zhì)含量高于5μg即可測(cè)得，是測(cè)定蛋白質(zhì)含量應(yīng)用得最廣泛的方法之一。
【 實(shí)驗(yàn)材料 】
1.實(shí)驗(yàn)器材
100毫升容量瓶 2只；移液管 1毫升4支，5毫升2支；721型分光光度計(jì)。
2.實(shí)驗(yàn)試劑
(1) Fo1in-酚試劑甲：將lg碳酸鈉溶于50ml 0.lmol／L氫氧化鈉溶液中，再把0.5g硫酸銅(CuSO 4 ·5H 2 O)溶于100m1 1％酒石酸鉀(或酒石酸鈉)溶液，然后將前者50ml與后者lml混合。混合后1日內(nèi)使用有效。
(2)Folin-酚試劑乙：在1.5L容積的磨口回流瓶中加入100g鎢酸鈉(Na 2 WO 4 ·2H 2 O)、25g鉬酸鈉(Na 2 MoO 4 ·2H 2 O)、700ml蒸餾水、50ml 85％磷酸及100ml濃鹽酸，充分混勻后回流10h。回流完畢，再加150g硫酸鋰、50ml蒸餾水及數(shù)滴液體溴，開(kāi)口繼續(xù)沸騰15分鐘，以便驅(qū)除過(guò)量的溴，冷卻后定容到1000ml。過(guò)濾，如顯綠色，可加溴水?dāng)?shù)滴使氧化至溶液呈淡黃色。置于棕色瓶中暗處保存。使用前用標(biāo)準(zhǔn)氫氧化鈉溶液滴定，酚酞為指示劑，以標(biāo)定該試劑的酸度，一般為2mol／L左右(由于濾液為淺黃色，滴定時(shí)濾液需稀釋100倍，以免影響滴定終點(diǎn)的觀察)。使用時(shí)適當(dāng)稀釋(約1倍)，使最后濃度為lmol／L酸。
(3)標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液：用分析天平精密稱(chēng)取牛(或人)血清白蛋白100毫克，用少量蒸餾水完全溶解后，轉(zhuǎn)移至100毫升容量瓶中，準(zhǔn)確稀釋至刻度，使蛋白質(zhì)濃度1mg/ml。
(4)樣品溶液：配制約0.5mg/ml的酪蛋白溶液作為未知樣品溶液。
【 實(shí)驗(yàn)操作 】
1. 繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線
取7支 試管 ，按下表分別加入各試劑
試劑 管號(hào) | 0 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 |
標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液(ml) | 0.0 | 0.1 | 0.2 | 0.3 | 0.4 | 0.5 | 0.6 |
蒸餾水(ml) | 1.0 | 0.9 | 0.8 | 0.7 | 0.6 | 0.5 | 0.4 |
Fo1in-酚試劑甲(ml) | 5 | 5 | 5 | 5 | 5 | 5 | 5 |
搖勻，室溫下放置10分鐘
Fo1in-酚試劑乙(ml) | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 |
各管加入Fo1in-酚試劑乙后，立即搖勻，放置30分鐘后比色，在500nm處記下各管光密度，以0號(hào)管為對(duì)照，以光密度為縱坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。
2. 測(cè)定未知樣品：取2支 試管 ，分別準(zhǔn)確吸取1毫升樣品溶液，各加5毫升Fo1in-酚試劑甲，搖勻，室溫放置10分鐘后，再各加1毫升Fo1in-酚試劑乙，立即搖勻，放置30分鐘，在500nm處測(cè)定光密度值。
【 實(shí)驗(yàn)結(jié)果 】
根據(jù)未知樣品溶液的光密度值，在繪制好的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖中查出樣品溶液中的蛋白質(zhì)含量。
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