蛋白質(zhì)雙向電泳
【目的和要求】
1、 學(xué)習(xí)和掌握蛋白質(zhì)雙向電泳的基本原理和方法。
2、 了解雙向電泳技術(shù)在蛋白質(zhì)組 學(xué)研究中的應(yīng)用。
【實(shí)驗(yàn)原理】
蛋白質(zhì)的雙向電泳的第一向?yàn)榈入娋劢梗↖soelectrofocusing,IEF）,根據(jù)蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)不同進(jìn)行分離；第二向?yàn)?/span>SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳 （SDS-PAGE），按亞基分子量大小進(jìn)行分離。經(jīng)過(guò)電荷和分子量?jī)纱畏蛛x后，可以得到蛋白質(zhì)分子的等電點(diǎn)和分子量信息。
等電聚焦是一種特殊的聚丙烯酰胺 凝膠電泳，其特點(diǎn)是在凝膠中加入一種兩性電解質(zhì)載體，從而使凝膠在電場(chǎng)中形成連續(xù)的pH梯度。蛋白質(zhì)是典型的兩性電解質(zhì)分子，它在大于其等電點(diǎn)的pH環(huán)境中以陰離子形式向電場(chǎng)的正極移動(dòng)，在小于其等電點(diǎn)的pH環(huán)境中以陽(yáng)離子形式向負(fù)極移動(dòng)。這種泳動(dòng)只有在等于等電點(diǎn)的pH環(huán)境中才停止。如果在一種pH梯度的環(huán)境中將含有各種不同等電點(diǎn)的蛋白質(zhì)混合樣品進(jìn)行電泳，那么在電場(chǎng)作用下，不管這一群混雜的蛋白質(zhì)分子原始分布如何，各蛋白質(zhì)分子將按照它們各自的等電點(diǎn)大小在pH梯度相對(duì)應(yīng)的位置進(jìn)行聚集經(jīng)過(guò)一定時(shí)間后，不同的蛋白質(zhì)組分便分割在不同的區(qū)域之中。這個(gè)過(guò)程稱作等電聚焦蛋白質(zhì)聚集的部位蛋白質(zhì)所帶電荷為零，測(cè)定此部位的pH值，即可知該蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)。
十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE），主要用于測(cè)定蛋白質(zhì)亞基分子量，SDS是一種陰離子去污劑，作為變性劑和助溶劑，它能段裂分子內(nèi)和分子間的氫鍵，使分子去折疊，破壞蛋白質(zhì)分子的二級(jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu)。強(qiáng)還原劑則能使半光氨酸殘基之間的二硫鍵段裂。在樣品和凝膠中加入SDS和還原劑后，分子被解聚成它們的多肽鏈。解聚后的氨基酸側(cè)鏈與SDS充分結(jié)合形成帶負(fù)電荷的蛋白質(zhì)-SDS膠束，所帶的負(fù)電荷大大超過(guò)了蛋白質(zhì)分子原有的電荷量，這就消除了不同分子之間原有電荷的差異。因此這種膠束在SDS-聚丙烯酰胺凝膠系統(tǒng)中的電泳遷移率不再受蛋白質(zhì)原有電荷的影響，而主要取決于蛋白質(zhì)或亞基分子量的大小。當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)的分子量在15KD到200KD之間時(shí)，電泳遷移率與分子量的對(duì)數(shù)呈線性關(guān)系。
蛋白質(zhì)雙向電泳是將蛋白質(zhì)等電點(diǎn)和分子量?jī)煞N特性結(jié)合起來(lái)進(jìn)行蛋白質(zhì)分離的技術(shù)，因而具有較高的分辨率和靈敏度，已成為蛋白質(zhì)特別是復(fù)雜體系中的蛋白質(zhì)檢測(cè)和分析的一種強(qiáng)有力的生化手段。
【實(shí)驗(yàn)器材和試劑】
1、凝膠原液（28.38%Acr +1.62%Bis）。
2、TEMED原液。
3、過(guò)硫酸銨。
4、pH3.5～10、pH4～6、pH6～8兩性電解質(zhì)載體。
5、尿素。
6、10%非離子去污劑NP-40。
7、50mmol/L NaOH；。
8、25mmol/LH3PO4 。
9、SDS。
10、60mmolTris-Cl pH6.8。
11、2-巰基乙醇。
12、10倍SDS-PAGE電極緩沖液（0.25mol/L Tris-HCl,1.92mol/L 甘氨酸，1%SDS）。
13、0.05%溴酚藍(lán)。
14、1%瓊脂。
15、蛋白質(zhì)抽提液（30mmol/L Tris-HCl pH8.0,0.1mmol/LMgCl2,6mmol/L抗壞血酸，1%PVP，5%甘油，0.02% 2-巰基乙醇）。
16、丙酮。
17、研缽，石英砂，燒杯，試管，玻棒，量筒。
18、雙向電泳槽一套（包括圓盤電泳槽和垂直板狀電泳槽等），電泳儀。
北京天優(yōu)福康生物科技有限公司
官網(wǎng)：http://www.njjinzhong.com/
服務(wù)熱線：400-860-6160
聯(lián)系電話/微信：13718308763
QQ:2136615612 3317607072
E-mail：Tianyoubzwz@163.com
