蛋白質(zhì)DNS分析法DNS—Cl(膜層析技術(shù))
一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/span>
1.掌握DNS 分析法測定氨基酸的原理與方法。
2.進(jìn)一步熟悉薄膜層析的操作。
二、實(shí)驗(yàn)原理
熒光試劑二甲氨基萘磺酰氯即DNS—Cl(Dansyl—Cl)，能與所有氨基酸的氨基結(jié)合，生成熒光物質(zhì)DNS—氨基酸。DNS—Cl 也能與蛋白質(zhì)或多肽的游離氨基結(jié)合，生成DNS—蛋白質(zhì)或DNS—肽，經(jīng)酸水解后釋放出DNS—氨基酸。
各種DNS—氨基酸與聚酰胺薄膜形成氫鍵的能力個同，即在溶劑與聚酰胺薄膜之間的分配系數(shù)不一樣，故可用聚酰胺薄膜層析分離 各種DNS—氨基酸。DNS—氨基酸在360nm 或280nm 波長的紫外光照射下，發(fā)出黃色熒光，很方便進(jìn)行檢測。
蛋白質(zhì)和多肽經(jīng)酸水解后，肽鍵斷裂，生成游離氨基酸，所有氨基酸都能與DNS—Cl 反應(yīng)。所以DNS—Cl 法可用于蛋白質(zhì)或多肽氨基酸組成的微量分析。
在pH 值過高的情況下，DNS—Cl 會發(fā)生水解生成副產(chǎn)物DNS—NH2，DNS—OH 和DNS—Cl在紫外燈下產(chǎn)生藍(lán)色熒光，可以與DNS—Cl 的黃色熒光區(qū)分開來。
三、儀器、原料和試劑
儀器
層析缸、聚酰胺薄膜、電吹風(fēng)、紫外燈、毛細(xì)管、真空干燥箱、具塞磨口試管、水浴鍋、水解管(硬質(zhì)玻璃)等。
原料
蛋白或多肽樣品(如胰島素)
試劑
1. 各種層析純標(biāo)準(zhǔn)氨基酸
2. DNS—Cl 丙酮溶液：稱取250mgDNS—Cl 溶于100mL 丙酮中，貯于棕色瓶中，置冰箱保存，一個月內(nèi)穩(wěn)定
3. 三乙胺(重蒸)
4. 0.2mol/LNaHCO3溶液
5. 5.7mol/L 恒沸鹽酸
6. 展開溶液I： 88％甲酸：水＝1.5:100(V/V)
7. 展開溶液Ⅱ： 苯:冰醋酸＝9:L1(V/V)
8. 展開溶液Ⅲ： 乙酸乙酯：甲醇：冰醋酸＝20:1:1(v/v/v)
9. 展開溶液Ⅳ： 0.05mol/L 磷酸三鈉溶液:乙醇＝3:l(V/V)
10. 丙酮
四、操作步驟
1.標(biāo)準(zhǔn)氨基酸的DNS 化
分別稱取2—3moL 的層析純標(biāo)準(zhǔn)氨基酸以及樣品氨基酸，溶于0.5mL0.2 mol/L 的NaHCO3溶液中。各取0.1mL 于有玻璃塞的試管中，加入0.1mLDNS—C1丙酮溶液。檢查pH，必要時用三乙胺調(diào)pH 至9.0～9.5，于室溫(20℃左右)放置2~4h，用無離子水稀釋10倍，存于暗處備用。也可用商品DNS
—氨基酸直接使用。
2.DNS—蛋白質(zhì)的制備與水解
稱取0.5mg 蛋白樣品置具塞試管中，用少量蒸餾水溶解，加入0.5mL0.2 mol/L 的NaHCO3溶液，再加入0.5mLDNS—C1丙酮溶液。三乙胺調(diào)pH 至9.0～9.5，于室溫(20℃左右)放置2～4h。反應(yīng)完畢，真空抽去丙酮，用5.7mol/L 恒沸鹽酸轉(zhuǎn)移至水解管，抽真空封管，110℃水解18～24hr。開管后抽去鹽酸，加少量蒸餾水，再抽干，重復(fù)2～3次除盡鹽酸，得樣品1。臨用前加幾滴丙酮，進(jìn)行層析。
3.蛋白質(zhì)的水解及DNS—水解氨基酸液的制備
取蛋白樣品1～2mg 于水解管，加5.7mol/L 恒沸鹽酸50μL，110℃水解18～24hr。開管后抽去鹽酸，加少量蒸餾水，再抽干，重復(fù)2～3次除盡鹽酸。向水解管內(nèi)加入0.2 mol/L 的NaHCO3溶液50μL，再加入50μLDNS—C1丙酮溶液，三乙胺調(diào)pH 至9.0～9.5，于室溫(20℃左右)放置2—4h。反應(yīng)完畢，真空抽去丙酮，加20μL 甲醇溶解，得樣品2，點(diǎn)樣層析。
4.聚酰胺薄膜的準(zhǔn)備
將聚酰胺薄膜剪成7cm×7cm 的方塊，在距邊0.5cm 處畫互為垂直的兩條單線、交叉點(diǎn)為原點(diǎn)。若只做單向?qū)游觯瑒t只畫一條單線，在基線上每隔1cm 畫一點(diǎn)樣點(diǎn)。
5.點(diǎn)樣
用微量注射器或毛細(xì)管取樣1和樣2，分別點(diǎn)在不同位置上，點(diǎn)樣直徑應(yīng)小于2mm。若多次點(diǎn)樣，則點(diǎn)一次，吹干一次。
6.展開
將點(diǎn)好樣的聚酰胺薄膜卷成圓筒形，樣品側(cè)在筒內(nèi)，箍以線圈固定。放在小層析槽內(nèi)(可在小干燥器內(nèi)置一培養(yǎng)皿代替)，槽內(nèi)(培養(yǎng)皿)放入5～10mL 展開溶液Ⅰ進(jìn)行展開，以溶劑前沿到達(dá)距頂端0.5cnm 左右為止(約20分鐘)；取出膜片，吹干。
進(jìn)行雙向?qū)游鰰r，在第一相層析完畢且完全吹干后(有時需晾過夜，才能允分吹干)，將聚酰胺薄膜片轉(zhuǎn)90度，用展開溶液Ⅱ展開。為了區(qū)分DNS—蘇氨酸或區(qū)分DNS 天冬氨酸與DNS-谷氨酸，可在溶液Ⅱ展開后，吹干，接著用溶液Ⅲ沿同一方向展開，只需展開至一半高度即可。為了區(qū)分ε-DNS—賴氨酸、α-DNs—組氨酸與DNS—精氨酸，應(yīng)在溶劑Ⅱ中展開后，吹干，接著在溶液Ⅳ中沿同一方向展開。
7.DNS—氨基酸的檢測
展開結(jié)束后，取出薄膜，用吹風(fēng)機(jī)吹干，在360nm 或280 nm 的紫外光燈下檢測。DNS-氨基酸呈黃色熒光。此外還有其他顏色的雜點(diǎn)，如DNS—OH 顯綠色熒光等。
用樣品的層析譜與標(biāo)準(zhǔn)DNS—氨基酸層析譜相比較，樣1可鑒別蛋白樣品游離氨基酸種類，樣2可鑒別蛋白樣品的氨基酸組成種類。
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