羧肽酶的分離純化方法
【目的要求】
1.實驗目的
⑴ 通過學習生化及相關學科的理論和技術，熟悉并進一步掌握酶的提取、分離、純化、檢測及其生物學性質和理化性質的實驗技能。
⑵ 初步培養從總體水平進行實驗的設計，進一步加強并提高綜合分析解決問題的能力。
⑶ 培養科研工作中的協作精神和勤儉而高效的科研作風。
2.實驗要求
⑴ 本實驗由面包酵母為初始材料，制備高純度羧肽酶Y，對羧肽酶Y生化性質的檢測。
⑵ 通過相關文獻資料的收集、分析、設計本實驗的可行報告。
⑶ 可行性報告包括實驗目的、意義、國內外進展、實驗方法和技術路線及可行性分析、實驗預期結果。
⑷ 在本實驗開始前一個月，將實驗報告草案提交指導教師，以審核和準備實驗材料等。
⑸ 實驗報告草案應提供最少十篇文獻，其中至少有兩篇是近五年內的文獻，包括新技術、新方法在生物大分子 研究中的應用。
(6) 文獻按學術期刊論文的格式要求，即作者、文章名、刊名、年、卷(期)、頁碼，參考書籍類同。
⑺ 本實驗基本兩人一組，在部分實驗中需幾組合作進行。
⑻ 實驗報告包括：采用實驗的原理;實驗所需試劑、儀器、設備;提取、分離、純化的每步驟的蛋白回收率、活性回收率，最終產率;按實驗內容，提供實驗結果及相關圖表;完成實驗后從整體上進行相關的討論。
【實驗內容】
1.羧肽酶Y活性檢測
⑴ 酶活力測定方法
⑵ 酶活力單位定義
⑶ 比活力定義
⑷ 蛋白含量測定方法
2. 面包酵母羧肽酶Y的提取
⑴ 每組500克新鮮面包酵母
⑵ 利用溶解度等原理進行羧肽酶Y提取
⑶ 羧肽酶Y的活化
3. 羧肽酶Y的分離、純化
⑴ 利用各種方法，從上述提取液分離羧肽酶Y
⑵ 每步純化前蛋白純度檢測
⑶ 分離純化過程中跟蹤檢測活性組份蛋白質含量和酶活性
4. 羧肽酶Y理化性質
⑴ 采用兩種方法驗證羧肽酶Y純度
⑵ 羧肽酶Y的分子量測定
⑶ 羧肽酶Y的等電點測定
5. 羧肽酶Y的酶學性質
⑴ 在活力單位定義確定后，求出羧肽酶Y的Vmax和Km
⑵ 初步確定羧肽酶Y的最適pH
⑶ 初步確定羧肽酶Y的最適溫度
⑷ 提出最少兩種羧肽酶Y的可逆抑制劑并驗證抑制類型
⑸ 提出羧肽酶Y的激活性并驗證
(6) 羧肽酶Y的熱穩定性
【實驗原理】
羧肽酶Y(Carboxypeptidase Y)是由面包酵母中分離得到的一種蛋白水解酶，它對肽和蛋白質羧基末端的各種氨基酸(包括脯氨酸)具有廣泛的水解能力，因此該酶已成為C末端分析中常用的一種工具酶 。羧肽酶Y與胰羧肽酶A和B不同，它是一種不含金屬離子的酸性糖蛋白。
自1967年發現此酶以來，人們對它的理化性質、分子 結構以及應用等方面進行了研究。每分子羧肽酶Y約含有16個氨基葡萄糖(glucosamine)殘基和15%的己糖。其氨基酸組成中，酸性氨基酸含量較高，等電點為3.6。分子量約為61000Da，在280nm的消光系數
為15.0。該酶活性可被二異丙基氟磷酸(DFP)強烈抑制，因而認為它是屬于活性中心含有絲氨酸殘基的酶類。羧肽酶Y可被一些金屬離子如Cu2+，Hg2+，Fe2+，Mg2+等所抑制。因此在酶的分離制備過程中要防止與金屬離子接觸。
羧肽酶Y在蛋白質變性劑或某些溶劑存在下是相當穩定的，它與6mol/L尿素在25℃保溫1小時仍保留大約80%的活性。在10%甲醇存在下，25℃，pH5.5～8.0，8小時內該酶完全穩定。羧肽酶Y水溶液在25℃，pH5.5～8.0范圍內，它的活性在8小時內是穩定的。
在37℃，pH6～8，2小時內是穩定的。在低于pH3，60℃以上保溫時，酶迅速失活。該酶在飽合硫酸銨溶液中，在-20℃可長期保存。1%的酶溶液(pH7.0)在-20℃冰凍保存，二年內不失活。若稀釋到0.1mg/L則迅速失活。酶溶液的反復冰凍和融化或延長室溫貯存時間，可引起酶本身的自溶。
羧肽酶Y以酶原的形式存在于酵母細胞中，在分離制備時，首先用有機溶劑使酵母細胞自溶破裂，然后在pH5.0進行活化，將酶原轉變成酶。
經DEAE-纖維素柱層析 除去大量雜蛋白，再用DEAE-sephadexA-50柱進行純化。必要時再通過sephadexG-150柱，可得到更純的酶。經過以上分離純化步驟后，酶可提純400倍以上。用聚丙烯酰胺凝膠電泳鑒定為一條帶。
羧肽酶Y具有肽酶和酯酶活性，可用人工合成的苯甲氧羰二肽(CBZ-Phe-Leu)或N-乙酰酪氨酸乙酯(N-acetyl-L-tyrosine ethyl ester，簡稱ATEE)為底物，分別測定其肽酶活性或酯酶活性。一般多用紫外分光光度法測定酶活性。
【實驗材料】
1. 實驗器材
循環水式真空泵;蛋白紫外檢測儀;記錄儀; 紫外分光光度計; 梯度混合器(500ml);721型光分光光度計;高速冰凍離心機;冰箱;酸度計;部分收集器; 恒流泵;圓盤電泳裝置;恒溫水浴鍋;層析柱(2.6×50cm) (1.0×100cm) (0.6×30cm);布氏漏斗(500ml);吸濾瓶(1000ml);G-3砂芯漏斗(500ml);透析袋;玻璃棒;大燒杯(2000ml)。
2. 實驗試劑
⑴ DEAE-離子交換纖維素(DE-32)：稱取所需量，先用蒸餾水浸泡至全部溶脹，傾去液面漂浮的小顆粒，抽濾，用水洗至中性;再用0.5mol/L鹽酸浸泡30分鐘，抽干，用水洗至中性;用0.5mol/L氫氧化鈉浸泡30～60分鐘，抽干，用水洗至中性;最后再用0.5mol/L鹽酸浸泡30分鐘.
抽干，用水洗至中性;上柱前用所需緩沖液平衡。使用過的交換劑，須先用0.5mol/L氫氧化鈉-0.5mol/L氯化鈉溶液浸泡，用水充分洗滌后，再按上述方法處理。
⑵ DEAE-Sephadex A-50：處理方法同DEAE-離子交換纖維素(DE-32)，只是將0.5mol/L的酸、堿均改為0.1mol/L。浸泡時間縮短為20分鐘。
⑶ Sephadex G-150: 處理方法參見實驗五。
⑷ 四甲基乙二胺(TEMED);三羥甲基氨基甲烷(TRIS);十二烷基硫酸鈉(SDS);丙烯酰胺(ACM);甲叉雙丙烯酰胺(Bis);考馬斯亮蘭G250;
⑸ 兩性電解質(pH3～10);牛血清白蛋白(FBS);
(6) 0.5mmol/L苯甲氧羰-L-苯丙氨酰-L-亮氨酸(CBZ-Phe-Leu)-0.05mol/L pH6.5磷酸鹽緩沖液: 稱取5.17mg CBZ-Phe-Leu，溶于0.05mol/L，pH6.5磷酸鹽緩沖液，定容至25ml。
⑺ 1mmol/L N-乙酰酪氨酸乙酯(N-acetyl-L-tyrosine ethyl ester，簡稱ATEE )-0.05mol/L pH7.5磷酸鹽緩沖液：稱取6.25mg ATEE，溶于0.05mol/L，pH7.5磷酸鹽緩沖液，定容至25ml。
⑻ 奈氏試劑: 將10g碘化汞和7g碘化鉀溶于10ml水中，另將24.4g氫氧化鉀溶于內有70ml水的100ml容量瓶中，并冷卻至室溫。將上述碘化汞和碘化鉀溶液慢慢注入容量瓶中，邊加邊搖動。加水至刻度，搖勻，放置2天后使用。試劑應保存在棕色玻璃瓶中，置暗處。
⑼ 氫氧化鈉;鹽酸;氯仿;甲苯;新鮮面包酵母(1.5kg);固體硫酸銨; 乙醇;蒸餾水;甲醇;三氯醋酸;丙酮;乙酸;乙酸鈉(NaAc·3H2O)
【實驗操作】
1.酶的制備
⑴ 自溶：取1.5kg新鮮面包酵母，加入330ml氯仿，用不銹鋼勺或粗玻璃棒進行揉搓、攪拌，大約30分鐘后開始液化。置30℃水浴中保溫，用力攪拌，待完全液化后，加入600ml蒸餾水，攪勻。
用1mol/L氫氧化鈉溶液調到pH7.0，將混合液于25℃保溫2小時，復測溶液pH，再用1mol/L氫氧化鈉溶液調到pH7.0，于25℃繼續保溫16小時左右，使充分自溶。保溫完畢，將自溶混合物于4300g離心15分鐘，合并上清液(約1400ml),棄去殘渣。
⑵ 硫酸銨分級分離：向上清液中加硫酸銨粉末使達0.5飽和度 (313g/L,25℃)，邊加邊攪拌，用1mol/L氫氧化鈉溶液調到pH7.0, 放置2小時后，于8400g離心20分鐘，除去沉淀。再向上清液中慢慢加入硫酸銨粉末使達0.9飽和度(302g/L,25℃)，調到pH7.0，攪拌至硫酸銨固體完全溶解后，放置過夜。次日于13000g離心30分鐘，收集沉淀。若沉淀中母液較多,需抽濾至干，約得100g濾餅。
⑶ 活化：將濾餅溶于300ml 0.05mol/L，pH5.0乙酸鹽緩沖液中，滴加lmol/L乙酸調到pH5.0，并在溶液中加入5～10滴甲苯防腐。將溶液于25℃保溫活化18～20小時。活化完成后，留樣經透析后測活。
⑷ DEAE纖維素-32柱層析：上述活化液(約600ml)先用0.01mol/L, pH7.0磷酸鹽緩沖液進行透析，然后改用含0.1mol/L氯化鈉的上述緩沖液透析，用奈氏試劑檢查.透析外液中無銨離子為止。透析完畢后，將酶液上DEAE-纖維素-32柱(2.6×50cm)，該柱要預先用含0.1mol/L氯化鈉的0.01mol/L, pH7.0磷酸鹽緩沖液平衡。
當樣品吸附完畢后，開始線性洗脫。洗脫液為含氯化鈉的0.01mol/L, pH7.0磷酸鹽緩沖液，梯度混合器的貯液瓶放280mL含0.42mol/L氯化鈉的緩沖液，混合瓶放280mL含0.1mol/L氯化鈉的磷酸鹽緩沖液。流速30ml/h，4ml/管，用部分收集器收集。洗脫完畢，經過測活后收集酶蛋白活性峰。
⑸ DEAE-Sephadex A-50柱層析：先將上步所得酶活性峰溶液(約200ml)分裝于透析袋中，用飽和硫酸銨溶液進行反透析，使酶沉淀。然后調到pH7.0,于5℃放置10小時以上。在以20000g離心30分鐘，收集沉淀，將沉淀溶于少量的0.15mol/L氯化鈉-0.01mol/L, pH7.0磷酸鹽緩沖液，然后對此緩沖液透析。
透析完畢，將酶液(約10ml)上DEAE-Sephadex A-50柱層析(0.6×30cm)，該柱要預先用同一緩沖液平衡。樣品吸附完畢后，進行線性洗脫。洗脫液為含氯化鈉的緩沖液。梯度混合器的貯液瓶放120mL含0.5mol/L氯化鈉的緩沖液，混合瓶放120mL含0.15mol/L氯化鈉的磷酸鹽緩沖液。
流速為20ml/h，3ml/管。用部分收集器收集，紫外檢測儀于280nm處檢測，通過測活，合并酶活性峰的洗脫液。
⑹ Sephadex G-150柱層析: (若有必要可將上面得到的酶溶液經Sephadex G-150柱進一步純化)
將上步所得酶溶液按步驟(5)所述方法處理。經反透析分離沉淀，溶解和透析除去硫酸銨的酶溶液，再上Sephadex G-150柱(1.0cm×100cm)，該柱預先要用含0.15mol/L氯化鈉-0.01mol/L, pH7.0磷酸鹽緩沖液平衡。用同一溶液洗脫，流速4.5mL/h，1mL/管，用紫外檢測儀于280nm處檢測。洗脫體積相當于柱體積。通過此柱后，可得到單一的酶活性峰。經過測活及鑒定后，對飽和硫酸銨溶液反透析，將酶的混懸液于低溫冰箱保存。
2.酶活力的測定
⑴ 酯酶活力的測定：以ATEE為底物用分光光度法或滴定法測定酯酶活力。分光光度法具體操作如下：
取兩個石英比色池(帶蓋，光程為1cm)，其中一個加0.05mol/L, pH7.5磷酸鹽緩沖液，作為空白對照調零點。
另一個比色池加入2.80mL 1mmol/L ATEE—0.05mol/L, pH7.5磷酸鹽緩沖液(在25℃預熱5分鐘)，0.20ml酶液(用量一般含15μg酶蛋白)，立即混勻并記時，與237nm處測其光吸收(降低)，每隔半分鐘讀一次數。若△A237nm/min > 0.400，則酶液需要適當稀釋或減量。每水解1μmol底物引起光吸收降低0.1所需的酶量定為1個酶活力單位。
按以下公式計算羧肽酶Y的活力單位和比活力。
式中：△A237nm為任選的t時間間隔(min)內光吸收值的變化(降低);ε為測定時所用酶蛋白量(μg);1000為酶蛋白由μg換算成mg的轉換值;0.1為光吸收降低，0.1定為1個酶活力單位的常數。
⑵ 肽酶活力測定：一般用苯甲氧羰-L-苯丙氨酰-L-亮氨酸(CBZ-Phe-Leu)作為底物，用分光光度法或茚三酮溶液顯色法測定。
分光光度法用224nm測定光吸收的降低。底物用0.5mmol/L，CBZ-Phe-Leu-0.05mol/L, pH6.5磷酸鹽緩沖液，酶用量一般5～10μg蛋白，操作和計算方法與酯酶的活力測定類似。每水解1μmol底物引起光吸收降低0.2所需的酶量定為1個酶活力單位。
式中：△A237nm為任選的t時間間隔(min)內光吸收值的變化(降低);ε為測定時所用酶蛋白量(μg);1000為酶蛋白由μg換算成mg的轉換值;0.1為光吸收降低，0.1定為1個酶活力單位的常數。
⑶肽酶活力測定：一般用苯甲氧羰-L-苯丙氨酰-L-亮氨酸(CBZ-Phe-Leu)作為底物，用分光光度法或茚三酮溶液顯色法測定。
分光光度法用224nm測定光吸收的降低。底物用0.5mmol/L，CBZ-Phe-Leu-0.05mol/L, pH6.5磷酸鹽緩沖液，酶用量一般5～10μg蛋白，操作和計算方法與酯酶的活力測定類似。每水解1μmol底物引起光吸收降低0.2所需的酶量定為1個酶活力單位。
3. 蛋白質含量的測定：
采用Folin-酚試劑法進行測定。
4. 純度檢測：
采用聚丙烯酰胺凝膠電泳方法。
5. 理化和酶學性質的測定
學生可根據酶純化和活力測定的結果，運用已掌握的生化知識和實驗技能自行設計方案進行探索研究。
【實驗結果】
將實驗數據總結于下表：
步驟項目 | 體積(ml) | 總蛋白量(mg) | 總活力單位 | 比活力(單位/mg) | 回收率(%) |
1.自溶 | --- | ----- | ----- | ||
2.硫酸銨分級分離 | ----- | ----- | ----- | ||
3.活化 | 100 | ||||
4.DEAE-纖維素-32層析 | |||||
5.第一次DEAE-Sephadex A-50層析 | |||||
6.Sephadex G-150層析 |
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