分光光度法測定膽紅素(改良J—G 法)
一、實驗目的
1.掌握測定血清膽紅素的原理與方法。
2.深入了解膽紅素的生理作用。
二、實驗原理
血清與醋酸鈉—咖啡因—苯甲酸鈉試劑(咖啡因試劑)混合后，加入氯化重氟苯磺酸(重氮試劑)，生成紫紅色偶氮膽紅素，最后加入強堿性酒石酸鈉溶液，使顏色不穩定的紫紅色偶氮膽紅素在咖啡因存在下轉化為穩定的藍色偶氮膽紅素。醋酸鈉緩沖液保持偶氮反應的pH；咖啡因試劑中苯甲酸鈉—咖啡因促進未結合膽紅素溶解，破壞游離膽紅素分子 內的氫鍵，加速與重氮試劑的偶聯反應；疊氮鈉(或抗壞血酸)可終止結合膽紅素的偶氮反應。反應結束后，在600nm 波長比色，從標推曲線查找總膽紅素和結合膽紅素含量。
三、儀器和試劑
儀器
可見光分光光度計
試劑
1. 咖啡因試劑 無水醋酸鈉82g，苯甲酸鈉75g，EDTA Na2l.0g，溶于約500mL 的蒸餾水中，再加入咖啡因50g，攪拌至完全溶解，然后加蒸餾水稀釋至1000mL，過濾后放置棕色試劑瓶中，室溫保存可穩定6個月。
2. 5g/L 亞硝酸鈉溶液：亞硝酸鈉5.0g，加蒸餾水溶解并稀釋至100mL，若發現溶液呈淡黃色時，應丟棄重配。
3. 5g/L 對氨基苯磺酸溶液：對氨基苯磺酸5.0g，加于約800mL 蒸餾水中，加濃鹽酸15mL，待完全溶解后，加蒸餾水至1000mL。
4. 重氮試劑臨用前，取試劑20.5mL 與5g/L 對氨基苯磺酸溶液20mL 混合。
5. 5g/L 疊氮鈉溶液：疊氮鈉0.5g，用蒸餾水溶解并稀釋至100mL。
6. 堿性酒石酸鈉溶液：氫氧化鈉75g，酒石酸鈉(含2分子水)263g，加蒸餾水溶解并稀釋至1000mL，混勻，置塑料瓶中，室溫保存可穩定6個月。
7. 342μmol/L 膽紅素標準液：收集不溶血、無黃疽、清晰的血清作為混合血清稀釋劑。混合血清稀釋劑應符合下列要求：混合血1.0mL，加生理鹽水24mL，混勻。在分光光度計中，以比色杯光徑1cm，波長414nm，用生理鹽水調零，讀取的吸光度應小于0.100，波長460nm 處讀取的吸光度應小于0.040。
四、操作步驟
(一)膽紅素標準曲線的繪制
稱取符合標難的純膽紅素(MW584．68)20.0mg，加二甲亞砜4mL 溶解。在50mL 容量瓶中，加入混合血清稀釋劑約40mL，緩慢加入上述膽紅素二甲亞砜溶液2mL，邊加邊混勻，盡量避免產生泡沫，然后補加混合血清，稀釋至刻度，混勻。該標準液應避光置冰箱，可保存數天。但最好用于當天繪制標準曲線。
按表下表配制五種不同濃度的膽紅素標準液，表中各管充分混勻．然后按照血清總膽紅素方法進行測定。每一濃度平行做3管，以各濃度管吸光度值為縱坐標，以相應的膽紅素濃度為橫坐標，作圖，繪制出標準曲線。
(二)膽紅素的測定
按表下表的順序與加量進行操作。結合膽紅素管在加入重氮試劑混勻后準確1min，加入5g/L 疊氮鈉溶液0.05mL 和咖啡因試劑1.6m1，混勻，總膽紅素管室溫放置10min，然后向各管加入堿性酒石酸鈉1.2m1，混勻，用分光光度計660nm 波長，以空白管調零，讀取各管吸光度，從標準曲線上查出總膽紅素和結合膽紅素濃度。
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