DC與CIK共培養對肝癌細胞殺傷活性的研究
【摘要】 本研究的目的是觀察細胞因子誘導的殺傷細胞（CIK）與同源樹突狀細胞（DC）共培養后DC-CIK細胞的增殖活性、表型的變化，及其對肝癌細胞細胞毒作用的影響。采集健康供者的外周血單個核細胞（MNC），置于37℃，5% CO2培養箱培養2小時，收集非貼壁細胞用于誘導培養CIK細胞，貼壁細胞誘導分化出成熟DC，將成熟DC和CIK細胞按1∶5的比例混合培養3天，用MTT法檢測DC-CIK共培養細胞殺傷SMMC-7721肝癌細胞株的活性。結果顯示： DC與CIK細胞共培養后，DC-CIK細胞群的增殖活性和殺傷活性較單純的CIK細胞更高。結論： DC與CIK共培養細胞是一種增殖活性和細胞毒活性均高于CIK細胞的免疫活性細胞。
【關鍵詞】 肝癌細胞
近年來隨著細胞免疫學和分子生物學的發展，惡性腫瘤的細胞免疫治療已經開始在臨床應用，并取得一定療效。細胞因子誘導的殺傷細胞（cytokine induced killer cell，CIK）是一種高效、新型免疫活性細胞，是惡性腫瘤過繼免疫治療的重要手段之一。樹突狀細胞（dendritic cells，DC）是目前發現的功能最強的抗原呈遞細胞（APC），它通過處理、呈遞抗原，介導機體免疫應答。由于許多腫瘤宿主缺乏功能性DC而不能誘發抗原特異性T細胞應答，故在體外誘導功能性DC用于主動免疫治療具有重要的臨床應用價值。本實驗將成熟DC和CIK細胞共培養，觀察DC-CIK細胞群的增殖活性和表型變化，及其對肝癌細胞的體外殺傷作用。
材料和方法
主要試劑和儀器
IMDM完全培養基為Gibco公司產品，10%AB滅活血清為南京紅十字血液中心產品，AIM-V無血清培養基為Gibco公司產品，淋巴細胞分離液購自上海第二制藥廠，CD3單克隆抗體購自Ortho Biotech公司，IFN-α1b購自上海生物制品研究所，rhIL-2購自Chiron公司，rhGM-CSF，rhIL-1β，rhIL-4，rhIL-6，TNF-α和PGE-2均購自PEPRO Tech公司，MTT購自R＆D Systems公司）。正常人外周血取于4名健康供者。肝癌細胞株SMMC-7721為本實驗室液氮保存株。流式細胞儀為美國Becton Dickinson公司產品，透射電鏡為HITACHI公司產品。
CIK細胞的體外誘導和擴增
通過血細胞分離機從健康供者采集外周血單個核細胞（MNC），用淋巴細胞分離液（Ficoll）分離出MNC，用AIM-V無血清培養基調細胞濃度為（4-6）×106/ml，置于37℃、5% CO2培養箱培養2小時。收集非貼壁細胞，用含10%人AB血清的IMDM調細胞濃度為（1-2）×106/ml，并加入1 000 U/ml的IFN-α懸浮培養，24小時后加入1 μg/ml的CD3單克隆抗體和1 000 U /ml的rhIL-2，每隔3天半量換液1次，補充rhIL-2，調整細胞濃度始終為（1-2）×106/ml。
DC的體外培養
在PBMNC培養2小時之后的貼壁細胞中，加入含1 000 U /ml的GM-CSF和1 000 U /ml的IL-4的 AIM-V培養液，37℃、5% CO2培養箱培養。每3天換液1次并補充細胞因子，第6天加入上述細胞因子的同時還加入IL-1β、TNF-α、PGE-2等細胞因子誘導DC成熟，共培養8-9天。
DC與CIK細胞共培養
收獲的DC計數后和CIK按1∶5混合培養，共培養3天。
CIK及DC-CIK對腫瘤細胞的細胞毒作用的MTT測定
以培養12天的CIK、DC-CIK共培養物作為效應細胞，SMMC-7721肝癌細胞株為靶細胞。取對數生長期7721肝癌細胞，調整濃度為1×105/ml，CIK、DC-CIK的細胞濃度分別調整為2.5×105/ml、5×105/ml、1×106/ml、2×106/ml，效靶比依次為為2.5∶1、5∶1、10∶1、20∶1，實驗分3組，每組3個復孔，實驗組加效、靶細胞各100 μl/well，靶細胞組加入靶細胞、IMDM培養液各100 μl/well，效應細胞組加入效應細胞、IMDM培養液各100 μl/well，置37℃、5% CO2培養箱中孵育24小時，加入MTT試劑20 μl/well 37℃孵育4小時，再加入detergent reagent 100 μl/well 37℃孵育2小時，待充分溶解沉淀后于酶聯免疫檢測儀（波長570 nm）檢測吸光度（A），計算殺傷率。計算公式為：
殺傷率=［1-（A實驗孔-A效應孔/A靶細胞孔）］×100%
CIK、 DC、DC -CIK細胞群表型檢測
在DC培養的第9天用流式細胞儀進行免疫表型分析，在CIK細胞培養的第9、14、21天分別取少量細胞進行流式細胞術測定，DC-CIK共培養物共培養3天后進行流式細胞術測定。
DC透射電鏡觀察
將誘導培養至第9天的DC收獲，取1×106個細胞懸液，離心，細胞沉淀用2.5%戊二醛及1.0%的鋨酸固定，經乙醇梯度脫水，超薄切片鉛鈾染色后置透射電鏡下觀察。
統計學處理
采用SAS軟件進行t檢驗。
結果
細胞的增殖情況及形態觀察
CIK和DC-CIK的增殖活性
培養細胞在第3天開始出現增殖，第5天以后進入快速增殖期。DC-CIK共培養3天后，增殖速度明顯快于單純CIK細胞組（P<0.05），培養第17天時兩者增殖倍數相差1倍多。倒置顯微鏡下可見細胞呈集落樣懸浮生長，細胞體積明顯增大，培養期內細胞存活率均95%以上。
DC的增殖
培養的第2-3天細胞開始出現變形，拉長呈梭形、細樹枝狀及放射狀等各種不規則形態，部分細胞開始懸浮，貼壁細胞部分聚集成團；培養5-6天后，集落明顯增多，且有更多的細胞處于輕貼壁狀態；培養7-9天成熟后，大部分細胞開始懸浮，形態不規則，倒置顯微鏡下可觀察到大量具有毛刺狀突起的細胞，形態不規則，為典型的DC形態，有的細胞表面有圓形、星形及樹突樣突起。
DC的超微結構觀察
透射電鏡下，DC細胞表面有大量粗細不等的樹枝狀突起，胞體大，胞內線粒體豐富，溶酶體少見甚至沒有，細胞核大而不規則，呈馬蹄形、腎形或不規則型，核內異染色質明顯邊集。
細胞的表型分析
CIK表型分析
經流式細胞儀分析表明，CIK細胞屬于異質細胞群，隨著培養時間的延長，CIK細胞中CD3+CD8+ 、CD3+CD56+雙陽性細胞的百分含量大幅度上升。與DC共培養的CIK細胞CD3+CD8+、CD3+CD56+雙陽性細胞的百分含量進一步升高，經DC作用的CIK細胞與單純CIK細胞CD3+CD8+、CD3+CD56+的表達差異顯著。
DC表型分析
誘導成熟的DC經流式細胞儀分析顯示，有（83.65±1.41）%的細胞表達DC特異性表面標志CD1a，有（82.40±2.33）%的細胞表達成熟DC特異性表面標志CD83，（97.46±1.03）%的細胞表達HLA-DR，（96.39±0.83）%的細胞表達CD80，（96.35±1.14）%的細胞表達CD86，（87.35±2.04）% 的細胞表達CD40，只有（3.79±1.28）%的細胞表達CD14。這些均說明外周血單核細胞經一定的細胞因子體外誘導后，可以生成高純度的成熟的DC。
DC-CIK共培養物和CIK細胞的細胞毒活性
體外實驗表明： PBMNC在培養前的細胞毒活性很低，隨著培養時間的延長，細胞毒活性逐漸增強，14-21天時達高峰，以后逐漸下降。以肝癌細胞7721為靶細胞，在2 .5-20效靶比范圍內，DC-CIK共培養物對7721的殺傷活性均高于單純CIK細胞組，且差異顯著（P<0.05）。
討論
CIK細胞是一種非MHC限制性的高效溶腫瘤細胞毒性T細胞，其在外周血淋巴細胞中的比例為1%-5%。1991年，Schmidt-wolf等首先報道了CIK細胞。CIK細胞是人外周血單個核細胞在體外經多種細胞因子刺激后獲得的一群異質性細胞，其主要效應細胞表面既有T細胞表面標志（CD3），也有NK細胞表面標志（CD56），因而兼有T淋巴細胞抗瘤活性和NK細胞非MHC限制性殺瘤的特點。應用CIK細胞治療克服了過去過繼免疫療法的不足，如體外增殖數量少、需輸注IL-2、低效及副作用大等，現已經成為腫瘤生物治療的一種新方法。
樹突狀細胞（DC）是機體內最重要的、功能最強的抗原呈遞細胞（APC），最初是Steinman和Cohn等于1973年從小鼠脾組織中分離發現的。DC最大的特點是能激活初始型T細胞增殖并建立初級免疫應答；DC 激發T細胞增殖及抗原呈遞能力是巨噬細胞和B細胞的100-1 000倍。以外周血單核細胞為DC前體細胞誘導DC，是體外大量生成DC的一條重要途徑。GM-CSF可促進髓系細胞發育，是生成和維持DC發育和分化的最根本的細胞因子；IL-4抑制粒細胞和巨噬細胞產生，促進單核細胞向DC的轉化，并維持DC成熟；TNF-α和PGE2可阻止粒系的分化而刺激DC的成熟并增強其抗原呈遞能力。
Marten等將CIK和同源DC共培養后發現，DC分泌IL-12明顯增加，并使CIK細胞對腫瘤細胞的細胞毒活性明顯增強。阻斷IL-12對CIK細胞的作用，可以使CIK殺傷活性明顯減低。我們的實驗研究表明，DC-CIK細胞群比同源CIK細胞具有更強的增殖活性，共培養1周后DC-CIK的擴增倍數比同源CIK高約1倍。Zoll等的研究表明，IL-2和 IL-12對CIK細胞有促增殖作用，且IL-12使CIK細胞高表達對殺瘤活性起重要作用的CD56+細胞。成熟DC自身可分泌高水平的IL-2、IL-12和IFN-γ等細胞因子，因此與CIK細胞共培養后可提高CIK的增殖活性和細胞毒作用，這對于腫瘤臨床具有重要意義。
DC與CIK共培養過程中，CIK細胞中CD3+CD8+、CD3+CD56+的比例較單純CIK細胞有不同程度的增高，說明大量成熟DC進一步促進了CIK細胞的成熟。目前關于CIK殺傷靶細胞的原理尚未完全闡明，可能是通過黏附因子LFA/ICAM-1途徑與腫瘤細胞結合后，分泌含大量BLT酯酶的顆粒，這些顆粒能穿透靶細胞膜，導致腫瘤細胞的裂解；而且CIK細胞還能分泌IL-2，IL-6，TNF-α及GM-CSF等一些細胞因子，增強細胞毒作用；此外，CIK細胞還可通過直接靶向腫瘤細胞進行殺傷或誘導其凋亡。DC能進一步提高CIK對靶細胞的殺傷活性，其機制可能為： ①DC能分泌多種細胞因子，如IL-2、IL-12、IFN-γ等，促進CIK成熟； ②DC分泌高水平的IL-12，誘導Th1型免疫應答，有利于清除腫瘤細胞。因此，在今后的腫瘤臨床治療中，用DC-CIK回輸治療要優于直接CIK治療或DC治療。因為，DC和CIK同時回輸，已活化的CIK可以直接殺傷腫瘤細胞，而DC可繼續活化體內的T細胞，從而發揮較持久的抗腫瘤作用。
本研究表明，DC-CIK共培養能提高CIK對SMMC-7721肝癌細胞的殺傷活性，其殺瘤作用較單純CIK細胞更強。本研究為DC-CIK應用于肝癌臨床治療提供了可靠的依據，是將主動特異性免疫治療和過繼免疫治療相結合產生更有效的腫瘤免疫治療方法的新的探索。
北京天優福康生物科技有限公司
官網：http://www.njjinzhong.com/
服務熱線：400-860-6160
聯系電話/微信：13718308763
QQ:2136615612 3317607072
E-mail：Tianyoubzwz@163.com
