DNA重組（限制性酶切和連接）
學習目標：學習和掌握重組DNA的酶切、連接以及鑒定重組子的基本原理與實驗技術方法。
學習內容：質粒DNA和目的DNA的酶切、 瓊脂 糖凝膠電泳、質粒DNA和目的DNA的連接、感受態細胞的制備及重組DNA的轉化、重組子的篩選。
學習任務與要求：課前預習、課后總結；認真完成每一步實驗操作，詳細記錄實驗現象和結果并加以分析。
實驗時間安排表：
| 時 間 | 實 驗 內 容 |
| 第一天：8:00-8:30 | 準備限制性酶切反應體系 |
| 8:30-10:30 | 370C酶解3小時 |
| 10:30－13:00 | 純化酶切載體和目的基因 |
| 13:00-14:00 | 瓊脂 糖凝膠電泳 |
| 14:00-14:30 | 準備連接反應體系 |
| 14:30－第二天8:00 | 140C連接過夜 |
| 16:30－第二天8:00 | 預培養過夜 |
| 第二天：8:00-8:30 | 將過夜培養的菌液接入新的LB培養基中 |
| 8:30－11:30 | 菌液培養2.5－3小時 |
| 11:30-12:30 | 菌液冰浴保存、午飯 |
| 12:30-14:00 | 感受態細胞的制備 |
| 14:00-15:00 | 質粒DNA的轉化 |
| 15:00-17:00 | 復蘇、鋪Amp抗性平板、復蘇細胞涂平板和培養過夜 |
| 第三天早晨8：00 | 觀察結果（抗性平板上生長起來的菌體） |
| 16:30－第二天8:00 | 預培養過夜 |
| 第四天：8:00-11:30 | 質粒DNA的提取 |
| 12:00－15:00 | 質粒DNA的雙酶切 |
| 15:00－16:30 | 瓊脂糖凝膠電泳、觀察結果 |
實驗的常見問題、關鍵問題及難點：
微量操作、酶切體系的合理性、酶切是否完全、連接效率和轉化效率、感受態細胞的質量
可能的實驗結果：
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上圖顯示了不同同學的藍白斑篩選結果。只有轉入了外源質粒的菌株才可以在含有Amp的培 養基上生長，所以只要有菌落生長，無論是白斑和藍斑都說明轉化是成功的。但白斑不一定就是陽性重組子，因為實驗中將生色底物x-gal涂于培養基表面，并 不能保證每個區域都涂滿了x-gal，沒有生色底物的地方不管是陽性還是陰性菌落都不會顯藍色，所以有一部分的白色菌落是假陽性需要進一步驗證。
上圖顯示了將白斑小提質粒后的電泳鑒定結果。圖1和圖2是不同的同學的篩選結果。圖的上 半部分為提取質粒后直接電泳結果，下半部分為進行了雙酶切后的電泳結果。從圖中可以看出不進行酶切前重組質粒由于分子量較大而電泳遷移率較小。而雙酶切 后，由于重組質粒會被酶切成外源基因與質粒兩個分子所以電泳時會有兩條帶，而非重組質粒則只有一條帶。
造成重組失敗的原因主要有：
（1）質粒酶切不完全。雖然我們在酶切質粒后會電泳鑒定一下質粒是否變成單一的線性分子，但如果質粒只被單一的酶切開我們在電 泳時看到的也是線性的分子，而在連接時我們無法將帶有單一切口的質粒與外源基因相連，質粒本身卻可以重新連接成環型分子，并沒有重組。
（2）連接反應失 敗，外源基因不能與質粒分子重組成新的質粒分子。
（3）轉化不成功?？梢宰鲆粋€轉化空載體的對照實驗消除這方面的因素。
（4）極少數情況下發生外源基因之 間或質粒之間串聯。
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