蛋白復性（一）-綜述：包涵體表達的蛋白的復性
摘要
綜述了包涵體形成、包涵體分離和溶解、包涵體折疊復性的方法、復性產率低下的主要因素以及通過分子伴侶、低分子量添加物等的應用而提高了蛋白質復性產率。
關鍵詞
包涵體 蛋白質 復性
Abstract Strategies for decreasing the formation of inclusion bodies, isolation and resolution of inclusion bodies, refolding of inclusion body proteins and the cause of decreased refolding yields were included. Renaturation yield of recombinant protein have been improved by using some additives, such as molecular chaperone, small molecules.
Key words inclusion body , protein , renaturation
外源基因在大腸桿菌中的高表達常常導致包涵體的形成，雖然包涵體具有富集目標蛋白質、抗蛋白酶、對宿主毒性小等優點，但包涵體蛋白質的復性率一般都很低,而分子伴侶、低分子量添加物等在復性過程中的應用及新的復性方法的建立都大大提高了重組蛋白質復性產率。
一、包涵體：
1.1包涵體的定義、組成與特性：
包涵體是指細菌表達的蛋白在細胞內凝集，形成無活性的固體顆粒。 一般含有50%以上的重組蛋白，其余為核糖體元件、RNA聚合酶、內毒素、外膜蛋白ompC、ompF和ompA等，環狀或缺口的質粒DNA，以及脂體、脂多糖等，大小為0.5-1um，具有很高的密度（約1.3mg/ml），無定形，呈非水溶性，只溶于變性劑如尿素、鹽酸胍等。NMR等新技術的應用表明包涵體具有一定量的二級結構，他們可能在復性的啟動階段中具有一定的作用。[1]
1.2包涵體的形成：
主要因為在重組蛋白的表達過程中缺乏某些蛋白質折疊的輔助因子，或環境不適，無法形成正確的次級鍵等原因形成的。
1.2.1、基因工程菌的表達產率過高，超過了細菌正常的代謝水平，由于細菌的δ因子的蛋白水解能力達到飽和，使之表達產物積累起來。研究發現在低表達時很少形成包涵體，表達量越高越容易形成包涵體。原因可能是合成速度太快，以至于沒有足夠的時間進行折疊，二硫鍵不能正確的配對，過多的蛋白間的非特異性結合，蛋白質無法達到足夠的溶解度等。
1.2.2、重組蛋白的氨基酸組成：一般說含硫氨基酸越多越易形成包涵體，而脯氨酸的含量明顯與包涵體的形成呈正相關。
1.2.3、重組蛋白所處的環境：發酵溫度高或胞內pH接近蛋白的等電點時容易形成包涵體。
1.2.4、重組蛋白是大腸桿菌的異源蛋白，由于缺乏真核生物中翻譯后修飾所需酶類和輔助因子，如折疊酶和分子伴侶等，致使中間體大量積累，容易形成包涵體沉淀。
1.2.5、蛋白質在合成之后，于中性pH或接近中性pH的環境下，其本身固有的溶解度對于包涵體的形成比較關鍵，即是說，有的表達產率很高，如Aspartase和Cyanase,表達產率達菌體蛋白的30%,也不形成包涵體，而以可溶形式出現。[2]
1.2.6、在細菌分泌的某個階段，蛋白質分子間的離子鍵、疏水鍵或共價鍵等化學作用導致了包涵體的形成。
1.3包涵體破菌、分離、洗滌及溶解
1.3.1基因工程菌發酵液，經離心濃縮后，可用：機械破碎、超聲破碎：單純超聲破碎，在小規模下且菌量較少的情況下效果較好，由于能量傳遞和局部產熱等原因，很難用于大體積細胞懸液的破碎，這樣部分未破碎細胞與包涵體混在一起，給后期純化帶來困難。因此，在較大規模純化時先用溶菌酶破碎細菌的細胞膜，再結合超聲破碎方法，可顯著提高包涵體的純度和回收率。以及化學方法破碎使細菌裂解,然后以5000-20000g 15min離心，可使大多數包涵體沉淀，與可溶性蛋白分離。
1.3.2洗滌：為了除去包涵體上粘附的雜質，如膜蛋白或核酸，應用洗滌液洗滌包涵體，通常用低濃度的變性劑,過高濃度的尿素或鹽酸胍會使包涵體溶解，如2M尿素在50mM Tris pH7.0-8.5左右,1mM EDTA中洗滌。此外可以用溫和去垢劑TritonX-100洗滌去除膜碎片和膜蛋白。[3]
1.3.3溶解：一般用強的變性劑如尿素（6-8M）、鹽酸胍（GdnHCl 6M），通過離子間的相互作用，打斷包涵體蛋白質分子內和分子間的各種化學鍵，使多肽伸展，一般來講，鹽酸胍優于尿素，因為鹽酸胍是較尿素強的變性劑，它能使尿素不能溶解的包涵體溶解，而且尿素分解的異氰酸鹽能導致多肽鏈的自由氨基甲酰化，特別是在堿性pH值下長期保溫時。或用去垢劑，如SDS、正十六烷基三甲基銨氯化物、Sarkosyl等，可以破壞蛋白內的疏水鍵，也可溶解一些包涵體蛋白質。Kandula Suntha等人用TritonX-100來溶解Zymononas mobilis levansucrase包涵體蛋白。另外，對于含有半胱氨酸的蛋白質，分離的包涵體中通常含有一些鏈間形成的二硫鍵和鏈內的非活性二硫鍵。還需加入還原劑，如巰基乙醇、二硫基蘇糖醇（DTT）、二硫赤蘚糖醇、半胱氨酸。還原劑的使用濃度一般是50-100mM 2-BME或DTT，也有文獻使用5mM濃度。在較粗放的條件下，可以使用5ml/l的濃度。還原劑的使用濃度與蛋白二硫鍵的數目無關，而有些沒有二硫鍵的蛋白加不加還原劑無影響，如牛生長激素包涵體的增溶。對于目標蛋白沒有二硫鍵某些包涵體的增溶，有時還原劑的使用也是必要的，可能由于含二硫鍵的雜蛋白影響了包涵體的溶解。[4]
二、復性：
由于包涵體中的重組蛋白缺乏生物學活性，加上劇烈的處理條件，使蛋白的高級結構破壞，因此重組蛋白的復性特別必要。 通過緩慢去除變性劑使目標蛋白從變性的完全伸展狀態恢復到正常的折疊結構，同時去除還原劑使二硫鍵正常形成。一般在尿素濃度4M左右時復性過程開始，到2M 左右時結束。對于鹽酸胍而言，可以從4M開始，到1.5M 時復性過程已經結束。
2.1包涵體蛋白復性方法
2.1.1稀釋復性：直接加入水或緩沖液，放置過夜，缺點是體積增加較大，變性劑稀釋速度太快，不易控制。目前稀釋法主要有一次稀釋、分段稀釋和連續稀釋三種方式。
2.1.2透析復性：好處是不增加體積，通過逐漸降低外透液濃度來控制變性劑去除速度，有人稱易形成無活性蛋白質聚體，且不適合大規模操作，無法應用到生產規模。
2.1.3超濾復性：在生產中較多的使用，規模較大，易于對透析速度進行控制，缺點是不適合樣品量較少的情況，且有些蛋白可能在超濾過程中不可逆的變性。
2.1.4柱上復性：是最近研究較多并成功的在生產中應用的一種復性方法，包涵體蛋白變性后，在色譜柱上復性，大致可分成疏水柱復性及凝膠柱復性兩類。其中的凝膠柱復性均是用Sephacry1S-100或Superdex75 等分子篩填料，柱較長（40cm-100cm不等）。相比稀釋和透析兩種方法，色譜柱復性回收率高（高達90%以上）、快速、易放大，樣品稀釋倍數小（一般五倍左右）[5]
2.1.5高蛋白質濃度下的復性：通常有兩種方法，一是緩慢地連續或不連續地將變性蛋白加入到復性緩沖液中，使得蛋白質在加入過程中或加入階段之間有足夠的時間進行折疊復性；二是采用溫度跳躍式復性，即讓蛋白質先在低溫下折疊復性以減少蛋白質聚集的形成，當形成聚集體的中間體已經減少時，迅速提高溫度以促進蛋白質折疊復性。
此外，吸附法、反膠束法和雙水相萃取法等都可用蛋白質的復性。
2.2包涵體蛋白復性效率
復性是一個非常復雜的過程，除與蛋白質復性的過程控制相關外，還很大程度上與蛋白質本身的性質有關，有些蛋白非常容易復性，如牛胰RNA酶有12對二硫鍵，在較寬松的條件下復性效率可以達到95%以上，而有一些蛋白至今沒有發現能夠對其進行復性的方法如IL-11，很多蛋白的復性效率只有百分之零點幾，如在純化IL-2時以十二烷基硫酸鈉溶液中加入銅離子（0.05%SDS，7.5-30u mol/l CuCl2）的方法，25-37°C下反應3小時，再EDTA至1m mol/l終止反應，復性后的二聚體低于1%。[6]一般說來，蛋白質的復性效率在20%左右。
2.2.1影響復性效率的因素：
2.2.1.1蛋白質的復性濃度：正確折疊的蛋白質的得率低通常是由于多肽鏈之間的聚集作用，蛋白質的濃度是使蛋白質聚集的主要因素，因而，一般濃度控制在0.1-1mg/ml；如果變性蛋白加入復性液中過快，容易形成絮狀沉淀，可能是蛋白重新凝聚的緣故。所以我們采用再水浴和磁力攪拌下，逐滴加入變性蛋白，使變性蛋白在復性液中始終處于低濃度狀態。
2.2.1.2pH和溫度：復性緩沖液的pH值必須在7.0以上，這樣可以防止自由硫醇的質子化作用影響正確配對的二硫鍵的形成，過高或過低會降低復性效率，最適宜的復性pH值一般是8.0-9.0。[12]
此外，影響復性效率的因素還有，變性劑的起始濃度和去除速度、氧化還原電勢、離子強度、共溶劑和其他添加劑的存在與否等。
2.2.2提高包涵體蛋白的復性產率
2.2.2.1氧化-還原轉換系統
對于含有二硫鍵的蛋白，復性過程應能夠促使二硫鍵形成。常用的方法有：空氣氧化法、使用氧化交換系統、混合硫化物法、谷胱甘肽再氧化法及DTT再氧化法.
最常用的氧化交換系統是GSH/GSSG,而cysteine/cystine、cysteamine/cystamine、DTT/GSSG、DTE/GSSG等也都有應用。氧化交換系統通過促使不正確形成的二硫鍵的快速交換反應提高了正確配對的二硫鍵的產率。通常使用1-3m mol/l還原型巰基試劑,還原型和氧化型巰基試劑的比例通常為10：1—5：1。[7]
2.2.2.2添加低分子化合物
低分子化合物自身并不能加速蛋白質的折疊，但可能通過破壞錯誤折疊中間體的穩定性，或增加折疊中間體和未折疊分子的可溶性來提高復性產率。如鹽酸胍、脲、烷基脲、以及碳酸酰胺類等，在非變性濃度下是很有效的促進劑。蛋白質的輔因子、配基或底物亦可起到很好的促折疊作用，如蛋白質的輔因子Zn2 或Cu2 可以穩定蛋白質的折疊中間體,從而防止了蛋白質的聚集，加入濃度大于0.4 mol/lTris緩沖液可提高包涵體蛋白質的折疊效率。濃度為0.4-0.6M L-Arg有助于增加復性中間產物的溶解度。成功的應用于很多蛋白如t-PA的復性中，可以抑制二聚體的形成。
NDSBs是近年來出現的可促進蛋白復性的新家族, NDSBs由一個親水的硫代甜菜堿及一個短的疏水集團組成，故不屬于去垢劑,不會形成微束,易于透析去除，目前，常用的有NDSB-195，NDSB-201，NDSB-256。[8]
2.2.2.3PEG-NaSO4兩相法
用PEG和NaSO4作為成相劑,然后加入鹽酸胍，再把變性的還原的蛋白質溶液加入其中進行復性,但這種方法需復性的變性蛋白質的濃度必須低。[9]
2.2.2.4分子伴侶和折疊酶等
這類蛋白質主要包括硫氧還蛋白二硫鍵異構酶、肽酰-輔氨酰順反異構酶、分子伴侶、FK506結合蛋白、Cyclophilin等。分子伴侶和折疊酶等不僅可在細胞內調節蛋白質的折疊和聚集過程的平衡，而且可在體外促進蛋白質的折疊復性。[13]
2.2.2.5其它
提高復性率的策略還有許多，如：非離子型去垢劑，尤其是離子型或兩性離子去垢劑或表面活性劑CHAPs、Triton X-100、磷脂、laury lmaltosid、Sarkosyl等對蛋白質復性有促進作用；待折疊復性的蛋白質的抗體可有效協助其復性；多聚離子化合物如肝素不僅可以促進蛋白質的作用，而且具有穩定天然蛋白質的作用。[10]
2.3復性效果的檢測：
根據具體的蛋白性質和需要，可以從生化、免疫、物理性質等方面對蛋白質的復性效率進行檢測。
2.3.1、凝膠電泳：一般可以用非變性的聚丙烯酰胺凝膠電泳可以檢測變性和天然狀態的蛋白質，或用非還原的聚丙烯酰胺電泳檢測有二硫鍵的蛋白復性后二硫鍵的配對情況。
2.3.2、光譜學方法：可以用紫外差光譜、熒光光譜、圓二色性光譜（CD）等，利用兩種狀態下的光譜學特征進行復性情況的檢測，但一般只用于復性研究中的過程檢測。
2.3.3、色譜方法：如IEX、RP-HPLC、CE等，由于兩種狀態的蛋白色譜行為不同，
2.3.4、生物學活性及比活測定：一般用細胞方法或生化方法進行測定，較好的反映了復性蛋白的活性，值得注意的是，不同的測活方法測得的結果不同，而且常常不能完全反映體內活性。
2.3.5、黏度和濁度測定：復性后的蛋白溶解度增加，變性狀態時由于疏水殘基暴露，一般水溶性很差，大多形成可見的沉淀析出。
2.3.6、免疫學方法：如ELISA、WESTERN等，特別是對結構決定簇的抗體檢驗，比較真實的反映了蛋白質的折疊狀態。[11]
在正常的生理條件下，組成蛋白質的多肽鏈都能以獨特的方式進行折疊，形成自己特有的空間結構，以執行某一些生命活動。當外界環境改變時，可能造成基因突變和蛋白質序列改變，錯誤剪接和運輸，錯誤折疊和異常聚積，形成對機體有害的反應，引起構象病的發生和無生物活性、不可溶的包涵體形成。目前對包涵體形成和復性過程中發生聚集的機制尚不清楚，許多已建立的高效復性方法是在反復實驗和優化的基礎上建立的，且沒有普遍性，但從這許許多多的個例中發現了一些規律：如聚集的發生是由鏈間的疏水相互作用介導、聚集具有相對特異性、折疊中間體可能具有不同的作用等等，并利用這些知識建立了一些重組蛋白質高效復興性的方法。相信隨著結構生物學、生物信息學、蛋白質工程學及相關新技術和新設備的發展和完善，在不久的將來，預測和設計最佳復性方案將成為可能。
參考文獻
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2 重組包涵體蛋白質的折疊復性 馮小黎 生物化學與生物物理進展 2001;28(4)
3 Fischer B, Sumner I. Isolation, renaturation, and formation of disulfide bonds of eukaryotic proteins expressed in E.coli as inclusion bodies. Biotech Bioeng,1993,41(1)
4 王克夷 <<生命的化學>>,1999,19(5)
5 Werner M H, Clore G M, Refolding proteins by gel filtration chromatography. FEBS Lett, 1994,345(2)
6 孫彥 生物分離工程, 北京:化學工業出版社,1998
7 蛋白質復性 史晉輝 生命的化學 2000年第6期
8 Goldberg M E, Non-detergent sulphobetaines: a new class of molecules that facilitate in vitro protein renaturation . Fold Des, 1996,1(1)
9 Misawa S et al. Biopolym, 1999,51(4)
10 Lotwin J et al. Biotechnol & Bioeng, 1999,65(4)
11 de Bernardez C E. Refolding of recombinant proteins. Curr Opin Biotechnol,1998,9(2)
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13 Thomas J G, Ayling A, Baneyx F. Molecular chaperones, folding catalysts, and the recovery of active recombinant proteins fom E. Coli: to fold or refold. Appl Biochem Biotechnol,1997,66(3)
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