原位雜交實(shí)驗(yàn)所用探針
雜交實(shí)驗(yàn)所選擇的核酸探針可以分為兩種：克隆的或合成的。實(shí)驗(yàn)中，應(yīng)根據(jù)不同的雜交實(shí)驗(yàn)選擇相應(yīng)的核酸探針。一般來(lái)說(shuō)，可以選擇克隆的DNA或cDNA雙鏈探針。特別是當(dāng)存在特異的克隆，或當(dāng)DNA序列未知而又必須首先進(jìn)行克隆以便繪制酶譜和測(cè)序時(shí)，常常選用克隆探針。
RNA探針也是一類很有前途的核酸探針，由于RNA是單鏈分子，所以它與靶核酸序列的雜交反應(yīng)效率極高。克隆探針一般比寡核苷酸探針的特異性強(qiáng)，復(fù)雜性也高，并可獲得強(qiáng)的雜交信號(hào)。合成的寡核苷酸探針具有一些獨(dú)特的優(yōu)點(diǎn)：
①由于鏈短，其序列復(fù)雜度低，相對(duì)分子質(zhì)量小，所以，和等量靶位完全雜交的時(shí)間較克隆探針短；
②寡核苷酸探針可識(shí)別靶序列內(nèi)1個(gè)堿基的變化，因此短探針中堿基的錯(cuò)配能大大降低雜交體的Tm值；
③可大量合成，價(jià)格廉價(jià)。
在分子雜交技術(shù)的發(fā)展早期，較多使用放射性同位素如32P、35S等來(lái)標(biāo)記核酸探針，在相當(dāng)一段時(shí)間內(nèi)，放射性同位素被視為探針的傳統(tǒng)標(biāo)記物且發(fā)揮著重要作用，它有十分明顯的優(yōu)點(diǎn)如靈敏度高、特異性高以及方法成熟簡(jiǎn)便。但隨著分子雜交技術(shù)的發(fā)展，它的缺陷也越發(fā)突出：半衰期短，必須經(jīng)常標(biāo)記探針：如32P半衰期只有14.2天，放射強(qiáng)度逐漸衰減。35S的半衰期可達(dá)88天，但衰變能量只有32P的1/10，靈敏度較低，只能用于多拷貝基因的檢測(cè)。3H的半衰期雖長(zhǎng)達(dá)12.3年，但衰變能低，靈敏度太低。費(fèi)用高：需要用進(jìn)口 試劑 ，價(jià)格高。檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng)：用放射自顯影需要較長(zhǎng)的暴光時(shí)間。放射性同位素對(duì)人體有害，實(shí)驗(yàn)室和環(huán)境容易被污染，放射性廢物處理困難。因此，推廣使用受到限制。
鑒于放射性標(biāo)記探針在使用中的局限，促使非放射性標(biāo)記核酸探針得以迅速發(fā)展，現(xiàn)在許多領(lǐng)域已用非放射性標(biāo)記核酸探針取代放射性標(biāo)記核酸探針，從而推動(dòng)了分子雜交技術(shù)的發(fā)展和廣泛應(yīng)用。目前，非放射性標(biāo)記法可以分為兩大類：一類為酶促標(biāo)記法，另一類為化學(xué)標(biāo)記法。酶促標(biāo)記法常可更好地修飾DNA，以產(chǎn)生比非酶促法高的敏感性。其缺點(diǎn)是復(fù)雜、產(chǎn)量低、成本高，難以大規(guī)模推廣。
相比之下，化學(xué)標(biāo)記法便宜而簡(jiǎn)單，有些化學(xué)系統(tǒng)可將不同的檢測(cè)基因用相同的化學(xué)方法連接到DNA分子上。非放射性RNA探針很少用，因?yàn)榇蠖鄶?shù)標(biāo)記只適合于DNA探針。另外，RNA探針與DNA探針相比沒有明顯的優(yōu)越性，而在標(biāo)記、雜交和檢測(cè)過(guò)程中為了避免RNA降解還需要極為小心。
目前，應(yīng)用最為多的非放射性標(biāo)記物有三種：生物素、地高辛和熒光素。第一個(gè)被實(shí)際運(yùn)用設(shè)計(jì)的非放射性標(biāo)記DNA探針是生物素。這種早期探針的標(biāo)記方法是通過(guò)酶促聚合作用將生物素標(biāo)記的脫氧三磷酸核苷酸摻入到DNA中。雜交后，可以利用抗生物素蛋白或鏈菌抗生素蛋白-酶結(jié)合來(lái)檢測(cè)這些生物素標(biāo)記的探針。
地高辛標(biāo)記探針已有商品化 試劑 盒。地高辛作為一種半抗原，其修飾核苷酸的方式與 生物 素相似，也是通過(guò)一個(gè)連接臂將地高辛半抗原和核苷酸分子相連。標(biāo)記的核苷酸可利用一種單一堿性磷酸酶聯(lián)抗體，經(jīng)30~60 min溫浴即可達(dá)到與 生物 素標(biāo)記探針相同的靈敏度，甚至更高。當(dāng)要檢測(cè)內(nèi)源性生物素比較高的組織如腸胃系統(tǒng)時(shí)，如果用生物素標(biāo)記的探針進(jìn)行雜交，其雜交信號(hào)將受到非特異性信號(hào)（內(nèi)源生物素）的干擾，使其特異性降低。因此，目前地高辛的應(yīng)用比生物素更廣泛。
熒光素標(biāo)記核酸探針也有商品化試劑盒，其敏感性與地高辛和生物素相似。特別是在近期，隨著染色體熒光原位雜交技術(shù)的迅猛發(fā)展，使得熒光素標(biāo)記探針的開發(fā)和發(fā)展也有了突飛猛進(jìn)的進(jìn)步。
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