酚試劑法測(cè)定蛋白質(zhì)
【原理】
蛋白質(zhì)和堿性銅溶液作用（雙縮脲反應(yīng)）后，與銅絡(luò)合的蛋白質(zhì)中所含的酪氨酸和色氨酸殘基，使磷鉬酸——磷鎢酸（Fotin-Ciocalteau酚試劑）還原呈蘭色，蘭色的深淺與芳香族氨基酸的含量成正比，故可作比色法測(cè)定。
【操作】
1．標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：
取七支干燥中試管，編號(hào)，按下表操作：
混勻，放置10分鐘，每管加酚試劑0.5mL，迅速混勻。30分鐘后，以第6管為空白管，在波長(zhǎng)650nm比色，讀取光密度。
以1—5管蛋白質(zhì)濃度為橫坐標(biāo)，光密度為縱坐標(biāo)，作圖得標(biāo)準(zhǔn)曲線。畫好后注明所用儀器型號(hào)、編號(hào)，所用波長(zhǎng)，測(cè)定方法及制作日期。
根據(jù)第7管光密度，由標(biāo)準(zhǔn)曲線找出其對(duì)應(yīng)的濃度。并將樣品的濃度單位換算成蛋白質(zhì)（g）/100mL血清。
注：
1．在用堿性銅溶液處理后，蛋白質(zhì)發(fā)色能力增加3~15倍。加銅處理對(duì)酪氨酸與色氨酸的發(fā)色能力的影響較小，本法所顯顏色有1/4來(lái)源于雙縮脲反應(yīng)。
2． 檢樣內(nèi)蛋白質(zhì)的含量應(yīng)在300μg/mL以內(nèi)，濃度如超出這個(gè)范圍，反應(yīng)不呈線性關(guān)系。
3． 發(fā)色反應(yīng)在30分鐘內(nèi)即接近極限，在半小時(shí)至一小時(shí)內(nèi)顏色略有增加，在1.5~6小時(shí)內(nèi)顏色穩(wěn)定不變，因此，最好在發(fā)色后1.5~6小時(shí)內(nèi)比色。
【儀器】
1.15×15cm試管
2.刻度吸管（0.5mL，1mL，5mL）
3.721分光光度計(jì)
4.坐標(biāo)計(jì)
5.微量加樣器（500μL）
【試劑】
標(biāo)準(zhǔn)牛血清清蛋白溶液：準(zhǔn)確稱取牛血清清蛋白0.4g，溶于100mL0.9%NaCl溶液中，稀釋10倍使用。
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